Полимерные хроматографические колонны из - за их преимуществ, таких как широкий диапазон кислотно - щелочной устойчивости, сильная химическая стабильность, высокая механическая прочность и сложная применимая матрица, занимают важное место в области применения жидкой хроматографии (HPLC), такой как анализ пищевых продуктов, мониторинг окружающей среды, исследования и разработки лекарственных средств. Однако по мере увеличения количества использования загрязняющие вещества в образцах (например, белки, липиды, сильно удерживаемые органические вещества и т. Д.) постепенно адсорбируются на поверхность наполнителя хроматографической колонны или блокируют апертуру, что приводит к снижению эффективности колонны, снижению степени разделения, дрейфу времени удержания и другим проблемам. По сравнению с прямой заменой новой хроматографической колонны, научная регенеративная обработка может эффективно восстановить свойства колонны, продлить срок службы и снизить затраты на анализ. Эта система расчесывает тип загрязнения полимерной хроматографической колонны, подробно описывает целевые методы регенерации и рабочие точки, обеспечивает техническое руководство для стандартизированных лабораторных операций.
Основные принципы регенерации полимерной хроматографической колонны и предварительная подготовка
В основе регенерации лежит очистка загрязняющих веществ путем выбора подходящей системы растворителя без разрушения структуры полимерного наполнителя (например, избегая разрыва связи, деформации апертуры), защищая при этом целостность колонны. Перед регенерацией необходимо выполнить три ключевые подготовительные работы: во - первых, определить тип загрязнения, спекулировать свойства загрязняющих веществ в сочетании с матрицей образца, например, биологические образцы часто содержат белковые загрязнители, а образцы окружающей среды могут содержать остатки сильнополярных органических веществ; Во - вторых, собрать основную информацию о хроматографической колонне, ознакомиться с инструкцией, чтобы подтвердить материал наполнителя (например, полистирол - диэтиленбензол, полиметилакрилат и т. Д.), диапазон растворителя и толерантное давление (обычно полимерная колонна выдерживает давление ниже силиконовой колонны, как правило, не более 20 МПа); В - третьих, провести базовый тест производительности колонны, чтобы установить эталон сравнения производительности до и после регенерации путем измерения количества теоретических башен, степени разделения и коэффициента симметрии стандартных образцов (например, смешанных образцов бензола).
II. Адресные методы регенерации на основе типа загрязнения
Загрязнение полимерной хроматографической колонны можно разделить на обратимое адсорбционное загрязнение и необратимое осадочное загрязнение, необходимо выбрать стратегию очистки в соответствии с механизмом взаимодействия загрязняющих веществ и наполнителей, общие методы регенерации включают градиентную очистку, специальную очистку растворителем и комбинированную регенерацию.
i) Градиентная очистка и регенерация обычного обратимого адсорбционного загрязнения
Для загрязняющих веществ со слабой и средней удерживаемой прочностью в образце (например, большинство малых молекулярных органических веществ, некоторые полярные примеси), градиентная стирка может постепенно повышать прочность стирания растворителя для достижения десорбции загрязняющих веществ. Этот метод применим к обычному ежедневному техническому обслуживанию с незначительным загрязнением, и конкретные этапы работы заключаются в следующем: сначала промыть 10 цилиндрических объемов (CV) хроматографической колонны с низкой скоростью потока 0,5 мл / мин начальной фазой потока (например, системой метанола - воды) и удалить остаточные образцы в колонне; Затем пропорционально градиент для увеличения доли сильного растворителя стирания, например, от метанола - воды (50: 50, v / v) постепенно перейти к чистому метанолу (100%), поддерживая скорость потока 0,8 мл / мин промывки 15 - 20CV; если используется антифазный хроматографический режим и загрязнитель содержит полярные компоненты, можно дополнительно промыть 10CV метанолом - этанонитрилом (50: 50, v / v), чтобы повысить эффект стирания неполярных загрязнителей; Наконец, балансируйте 10 - 1CV фазой начального потока, пока исходный уровень не стабилизируется. Этот метод имеет небольшое повреждение полимерных наполнителей, а скорость восстановления после регенерации обычно достигает более 85%.
ii) Специальная регенерация растворителей с сильным сохранением органического загрязнения
Когда образцы содержат полициклические ароматические углеводороды, длинные цепные жирные кислоты и другие сильно удерживаемые органические вещества, обычная градиентная стирка трудно удалить, необходимо использовать специальную систему растворителей для разрушения гидрофобного взаимодействия между загрязнителем и наполнителем. Для полимерных колонн типа полистирол - диэтиленбензол (PS - DVB) рекомендуется трехступенчатый метод промывки "метанол - тетрагидрофуран - метанол": сначала промыть 10CV чистым метанолом для удаления поверхностных остатков, затем использовать тетрагидрофуран (THF) в качестве мощного моющего средства, промыть 20 - 30CV с низкой скоростью 0,3мл / мин для удаления гидросорбционных загрязнителей с использованием сильной растворимости THF; Поскольку THF оказывает незначительное растворение на полимерные наполнители, необходимо затем промыть 15 CV чистым метанолом, постепенно сокращать апертуру наполнителя и смывать остатки THF; В конце уравновешивается начальным потоком. Если загрязнитель является сильным полярным веществом (например, аминокислотными соединениями), в систему стирки можно добавить 0,1% (TFA), чтобы ослабить полярное взаимодействие путем регулирования pH, но обратите внимание, что концентрация TFA не должна превышать 0,5%, и после регенерации необходимо нейтрализовать 5CV раствором метанола, содержащим 0,05% аммиака, чтобы избежать кислотного остаточного коррозионного слоя.
iii) Комплексная регенерация ферментов - растворителей, загрязненных макромолекулами
После анализа биологических образцов (например, сыворотки, мочи, растительных экстрактов), белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и другие биологические макромолекулы легко адсорбируются на поверхности полимерного наполнителя гидрофобным действием или водородными связями и даже образуют отверстие для блокирования гелеобразного осаждения, эффект простого растворителя ограничен. На этом этапе необходимо использовать комбинированную стратегию регенерации « ферментативная предварительная обработка + промывка растворителем»: сначала приготовьте буферный раствор (pH7.0 фосфатный буфер), содержащий протеаза (например, протеаза поджелудочной железы, концентрация 0,1 мг / мл), промыть хроматографическую колонну 30CV со скоростью потока 0,2 мл / мин и статически при температуре 37°C при температуре менее 2, чтобы ферменты полностью разложили белковые загрязнители; Затем промыть 10 CV раствором воды 5% метанола для удаления остаточного ферментативного раствора, затем смыть по последовательному градиенту « вода - метанол - этанол - этанол - метанол», промыть 15 CV на каждом этапе растворителя, скорость потока контролируется 0,5 мл / мин; Наконец, 5CV (ингибирующее микробное размножение) промывается метаноловым раствором, содержащим 0,01% азида натрия, и запечатывается чистым метанолом. Этот метод регенерации биозагрязняющих столбовТаким образом, число теоретических башен может быть восстановлено до более чем 80% новой колонны.
iv) Промывание и регенерация солей и загрязнения твердыми частицами
Когда текучая фаза содержит буферные соли (например, фосфат, ацетат аммония) или образцы содержат взвешенные частицы, на входе в колонну легко образуются кристаллы соляного анализа или осадки частиц, что приводит к аномальному повышению давления колонны. Реабилитация такого загрязнения сосредоточена на "низкоинтенсивном растворении + физической промывке": сначала хроматографическая колонна соединяется в обратном направлении (чтобы избежать попадания загрязняющих веществ глубоко в слой колонны), 20 CV промывается сверхчистой водой на низкой скорости 0,3 мл / мин, растворяя кристаллы солей; Если давление столба все еще высокое, вы можете переключиться на 5 - процентный раствор метанола для промывки 15CV, используя слабую способность метанола для удаления частиц; Для твердых частиц можно поочередно промывать три цикла « вода - метанол - вода», отслаивая осадки силой сдвига, создаваемой изменением вязкости растворителя. Обратите внимание, что во время промывки давление не должно превышать хроматографической колонны.Устойчивы к давлению 80%, и после регенерации требуется прямое соединение, которое уравновешивается начальным потоком до базовой стабильности.
Ключевые аспекты регенерации и оценка эффективности
Эксплуатационные нормы в процессе регенерации напрямую влияют на эффект восстановления производительности колонны и срок службы, должны строго следовать четырем принципам: во - первых, контролировать скорость потока и давление, на протяжении всего процесса использовать низкую скорость потока (0,3 - 0,8 мл / мин) для запуска, чтобы избежать внезапного повышения давления, приводящего к коллапсу колонны, пик давления не превышает верхнего предела, указанного в инструкции; Во - вторых, чтобы избежать мутации растворителя, при переключении различных растворителей необходимо использовать градиентный переход (например, метанол при переключении на THF, постепенное изменение пропорции по 10 - процентному градиенту), чтобы предотвратить полярную мутацию растворителя, вызванную неравномерным растворением наполнителя; В - третьих, запрещается использование запретных растворителей, таких как полиметилакриловые полимерные колонны, избегающие хлороформа, дихлорметана и других галогенированных углеводородных растворителей, столбики PS - DVB избегают длительного воздействия сильных щелочных растворителей (pH > 12); В - четвертых, после регенерации герметичной защиты, краткосрочного использования с чистым метанолом или ацетонитрилом, долгосрочное хранение должно регулярно заменять герметизированный растворитель (каждые 3 месяца).
Оценка регенеративного эффекта должна быть проверена тремя основными показателями: количество теоретических башен (действительное увеличение более чем на 50% по сравнению с периодом до регенерации), степень разделения (степень разделения соседних пиков восстанавливается более чем до 1,5) и относительное стандартное отклонение времени удержания (RSD < 2%). Если после многократной регенерации степень разделения стандартного образца все еще ниже 1,0 или давление столба продолжает повышаться более чем на 50% от новой колонны, это означает, что хроматографическая колонна не может эффективно регенерироваться и требует замены новой колонны.
IV. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Регенеративный эффект полимерной хроматографической колонны зависит от точности определения типа загрязнения и соответствия метода регенерации. При ежедневном использовании следует установить режим управления « профилактика приоритетной, иерархической регенерации»: путем предварительной обработки образцов (например, фильтрации, экстракции) уменьшается поступление загрязняющих веществ, регулярно проводится легкий градиент стирания и обслуживания; Точный выбор стратегий регенерации, таких как ферментализ и специфические растворители, для различных типов загрязнения и строгий контроль эксплуатационных параметров. Научная регенеративная обработка может не только значительно снизить стоимость лабораторных расходных материалов, но и обеспечить точность и надежность аналитических данных путем поддержания стабильности производительности колонны, что обеспечивает сильную поддержку для эффективного проведения работы по хроматографии жидкой фазы.