Для доставки генов из труднопреображаемых клеток ученые из Национального университета Сингапура создали встроенную систему доставки генов с использованием микроклеточной капсулярной технологии (mCVT), которая использовала липидный экструдер американской компании Genizer и опубликовала результаты в журнале Nanoscale. Полное название оригинала: Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

Исследователи из Национального университета Сингапура представили новую систему встроенных платформ доставки генов на основе технологии микроклеточных капсул (micro Cell Vesicle Technology mCVT). Эта система платформы доставки генов состоит из слияния клеточных мембран и катионных липидов и используется для повышения эффективности транскрипции клеток, которые трудно транскриптировать (hard - to - transfect HTT). Клеточный мембранный состав микрокапсульных пузырьков придает всему комплексу цитоплазматическую специфичность, уменьшая токсичность комплексных клеток во время транскрипции, в то время как катионные липиды отвечают за сочетание с генетическим материалом, обеспечивая структурную целостность мЦВТ.

Справочная информация

Передача генов - это процесс введения чужеродной ДНК в эукариоты. Например, передача терапевтических или функциональных генов для изменения клеточных процессов в фундаментальных исследованиях (таких как открытие лекарств и механические исследования функциональных белков) и клинических применениях (таких как генная терапия). Эффективная транскрипция генов требует не только успешного введения чужеродных нуклеиновых кислот в клетки, но и их последующего переноса и экспрессии в клетках. Это сложная задача, потому что молекулы ДНК сами по себе имеют отрицательный заряд, поэтому их трудно интернализировать в клетках в их обычной форме. В результате возник большой интерес к разработке эффективных систем передачи генов. За последние несколько десятилетий было исследовано большое количество систем носителей, от систем доставки на основе вирусов до неинвирусных носителей. Несмотря на относительно низкую транскрипционную эффективность неинвирусных носителей доставки генов, ожидается, что они станут безопасными и клинически приемлемыми, причем основными примерами являются катионно - липидные системы и платформы на основе полимеров. В таблице 1 кратко излагаются основные преимущества и недостатки широко используемых в настоящее время транскрипционных реагентов или методов.

Идеальная антивирусная система доставки генов должна быть в состоянии эффективно доставлять необходимые молекулы ДНК в определенные типы клеток с минимальной токсичностью для обеспечения максимальной экспрессии целевых генов. Тем не менее, насколько нам известно, транскрипционные реагенты, которые в настоящее время продаются на рынке, явно не соответствуют этим стандартам, особенно когда они используются для транскрипции труднотранскриптивных (HTT) клеток.

Клетки HTT обычно включают в себя протоклетки, эмбриональные стволовые клетки и некоторые линии вечных биохимических клеток, такие как 3T3 - L1 (прежировые клетки мышей), U937 (мононуклеарные клетки человека), Jurkat (человеческие Т - лимфоциты), HUVEC (эндотелиальные клетки пуповинной вены человека) и так далее. Согласно статистике, эффективность транскрипции плазмиды HTT - клеток с использованием доступных на рынке реагентов часто не превышает 25%. Одной из причин низкой абсорбции HTT - клеток чужеродными веществами и плазмидами является их низкая метаболическая активность. Кроме того, эти клетки, как правило, очень чувствительны к клеточным возмущениям, вызванным используемыми транскрипционными реагентами, которые могут привести к клеточной токсичности, которая в конечном итоге приведет к гибели клеток.

В последнее время значительное внимание было уделено системам доставки клеточного происхождения, которые могут в определенной степени специфически доставлять активные молекулы груза к месту назначения. На самом деле, многие исследования исследовали использование мононуклеотидных систем доставки лекарств (DDS) для направленной доставки химиотерапевтических препаратов и плазмидной ДНК (pDNA) в опухоль или использование эритроцитных DDS для продления кровообращения и направленной доставки pDNA в клетки крови. Предполагается, что сохранение клеточного мембранного компонента материнских клеток даст этим клеточным системам доставки лекарств возможность распознавать конкретные целевые клетки, возможно, избегая способности иммунной системы организма распознавать их.

Несмотря на большое терапевтическое значение, весь потенциал клеточного ДДС в передаче генов до сих пор в значительной степени не реализован. Ключевые проблемы, которые необходимо решить, включают громоздкие и низкопоточные процессы разделения / производства DDS клеточного происхождения (например, экзосомные формы) и субоптимальные методы загрузки / композиции генов. Таким образом, в то время как эти системы, по - видимому, имеют преимущества с точки зрения таргетирования, они имеют значительные ограничения с точки зрения производительности и эффективности загрузки pDNA. Поэтому, чтобы преодолеть эти ограничения, мы предлагаем разработать новый тип встроенной системы доставки генов, состоящей из клеточных мембранных и катионно - липидных компонентов, которые используются для усиления интернализации клеток - мишеней, а вторые для усиления загрузки pDNA.

В этом исследовании мы описали развитие микроклеточной капсулярной технологии (mCVTS), новой гибридной платформы доставки, полученной путем слияния катионных липидов с клеточными мембранами. Для производства mCVTs клетки сначала обрабатываются низкопроницаемым раствором, чтобы получить клетки - призраки (CG без цитоплазмы в клетках - клетках), как описано Goh et al. Растворы с низким просачиванием образуют короткие отверстия на плазменной мембране, что позволяет очищать содержимое клетки, сохраняя при этом целостность плазменной мембраны. CG из различных клеток, взвешенных в водной среде, используется для гидратации сухой липидной пленки DOTAP, которая затем выдавливается с помощью липидного экструдера, обеспечивая средний гидродинамический размер и потенциал Zeta, похожий на экструдированный липид DOTAP. В этом исследовании мы показали, что mCVTs может синтезироваться с плазмидами и интернализироваться клетками - мишенями с наименьшей токсичностью для клеток. Интересно, что при сравнении MCVTs, генерируемых из разных типов клеток вне организма, они показали значительно более высокую транскрипционную эффективность для типов клеток, из которых они исходят.

Методология и результаты

Подготовьте клетки - призраки (CG без цитоплазмы и клеточных мембран) для обеспечения повторяемости и безопасности mCVTs.

Методология и результаты

Производство и характеристики MCVTS.

Подобно производству липидов, липидные пленки используются для производства mCVTs. Пленка DOTAP гидратируется с CG, образуя большие полимолекулярные липиды, которые покрывают CG. Эта суспензия выдавливается, а серозная оболочка из CG содержит липид DOTAP (как показано на рисунке 3A). В соответствии с методами, ранее разработанными нашей группой, доказано, что после экструзии образующиеся таким образом мЦВТ состоят из слияния липидов и CG - мембран. Как правило, распределение мCVT по размеру аналогично распределению липидов. Чтобы продемонстрировать устойчивость и универсальность этого метода в различных клеточных линиях, mCVTs были изготовлены с использованием CG из разных клеточных линий, таких как некоторые HTT - клетки (т. е. 3T3 - L1) и нераковые клетки (т. е. HEK293 и RAW264.7). Как показано на рисунке 3B, гидродинамические размеры и PDI различных мCVTs обычно находятся в диапазоне 400 нм (PDI - 0,4), аналогичном липидам DOTAP (PDI - 0,2), произведенным с использованием того же метода экструзии. На рисунке 3C различные формулы наблюдали аналогичные значения потенциала зеты (около + 30 мВ до + 40 мВ), что указывает на то, что этот метод в целом применим к CG, генерируемому из различных клеточных линий. Интересно, что, когда mCVT3T3 - L1 спаривается с pDNA, его распределение по размеру аналогично распределению mCVTs без репликации, а общий потенциал зеты становится отрицательным, что может указывать на успешное спаривание (поскольку pDNA с отрицательным электричеством нейтрализует позитронный mCVTS).

А. Схема mCVTs, включающая слияние клеточных призраков и липидов, изготовленных из гидратированных пленок.

В. Гидродинамические размеры различных мCVTs и мCVT3T3 - L1 с плазмидами по сравнению с липидами DOTAP. Все мЦВТ имеют размеры менее 500 нм.

C. По сравнению с липидом DOTAP различные мCVTs и зета - потенциалы mCVT3T3 - L1 с плазмидами. Потенциал Zeta для всех mCVTS составляет более + 30 мВ, за исключением mCVT3T3 - L1 с плазмидной ДНК (5 мкг), которая показывает отрицательный потенциал Zeta из - за взаимодействия с плазмидной ДНК. Данные представляют среднее значение ±SD (n = 3).