Использовать точкуLUNA-FX7 ™ Автономный цитометр оптимизирует оценку сперматозоидов

ключевое слово:: Автономный клеточный счетчик, оценка сперматозоидов на основе изображений, подсчет клеток, оценка выживаемости, двойное окрашивание

1 Введение

Оценка сперматозоидов (также известная как анализ спермы) играет важную роль в определении мужского фертильного потенциала. Несмотря на то, что он не является непосредственным показателем фертильности, мужская фертильность оказывает значительное влияние как на фертильность человека, так и на разведение в животноводстве, поэтому оценка сперматозоидов вызывает большую озабоченность.

В настоящее время оценка сперматозоидов может проводиться с помощью проточной цитологии и инструментов анализа на основе изображений. Скачать LUNA - FX7 ™ Автоматизированные устройства, такие как автоматические клеточные счетчики, могут быстро и легко анализировать образцы спермы с помощью изображений. Однако, поскольку сперматозоиды отличаются морфологическими и свойствами по сравнению с клетками млекопитающих, необходимо оптимизировать параметры анализа и выбрать подходящий краситель.

В этом исследовании был проведен сравнительный анализ флуоресцентных красителей, таких как SYBR14, акридиновый апельсин (AO) и йодид пропилена (PI), чтобы оптимизировать точку LUNA - FX7 ™ Способность оценивать сперматозоиды. Целью исследования является оценка эффективности различных комбинаций красителей и оптимизация параметров для оценки сперматозоидов.

2 Методы и материалы

2.1 Подготовка образцов

Отморозьте образцы замороженной спермы крупного рогатого скота и замените буфер PBS. В зависимости от образца образец спермы был разбавлен в PBS примерно в соотношении 1: 20 - 1: 40.

2.2 Флуоресцентное крашение

1. Смешанные:

Сперматические клетки в 18 мкл PBS

2 мкл смеси зеленых и красных флуоресцентных красителей

Инкубация при температуре 37°C в течение 10 минут

Загрузить образец на подходящий носитель

Использование точки LUNA - FX7 ™ Провести анализ

Таблица 1. Точка LUNA - FX7 ™ Оптимизация параметров для оценки сперматозоидов в расширенном режиме

3 Оптимизация схемы подсчета клеток и комбинации красителей для оценки сперматозоидов

резюмеДвойное окрашивание SYBR14 / PI и AO / PI подходит для оценки активности сперматозоидов, но SYBR14 / PI работает лучше.

Скачать LUNA - FX7 ™ Протокол по умолчанию оптимизирован для обычных клеток млекопитающих, но оценка сперматозоидов требует корректировки таких параметров, как уровень экспозиции, размер клетки и чувствительность к воссоединению. Например, минимальный размер поиска был скорректирован с 3 мкм до 7 мкм, а чувствительность к воссоединению была скорректирована с 5 до 7, чтобы улучшить производительность обнаружения (таблица 1). Кроме того, уровни экспозиции для окрашивания SYBR14 / PI и AO / PI установлены на уровне GF 6 и RF 9 соответственно.

На этой основе мы провели сравнительный анализ методов окраски SYBR14 / PI и AO / PI. Учитывая известную эффективность крашения SYBR14 / PI в оценке сперматозоидов, мы обеспокоены результатами крашения AO / PI. Результаты исследования показывают, что для оценки сперматозоцитов могут использоваться два метода окрашивания (рисунок 1). Тем не менее, SYBR14 лучше подходит для окрашивания сперматозоидов, чем AO, что указывает на то, что химические свойства SYBR14 могут быть более подходящими для этого применения.

Рисунок 1. Флуоресцентные изображения сперматозоидов, окрашенных двумя различными красителями (SYBR14 / PI и AO / PI). На этом комбинированном изображении показаны проанализированные изображения открытого поля, зеленого света, красного света и меток. Отмеченные изображения представляют собой изображения комбинированных флуоресцентных каналов, где красные круги обозначают мертвые клетки, а зеленые круги - живые клетки.

4 заключение

Это исследование показало, что SYBR14 / PI и AO / PI - хроматики могут быть использованы для оценки выживаемости сперматозоидов, но SYBR14 / PI работает лучше. Кроме того, корректировка уровня экспозиции и других параметров имеет решающее значение для общей производительности обнаружения. Несмотря на то, что LUNA - FX7 ™ Он не оптимизирован специально для образцов спермы, но благодаря рекомендуемой пропорции разбавления образцов и оптимизации условий визуализации он по - прежнему предлагает быстрые и удобные схемы оценки сперматозоидов.