Резюме: Потребление глюкозы глюкозы глутаминовой палочкой происходит главным образом через систему трансферазы глицерофосфата (PTS), которая обладает высокой сродством к глюкозе (Km = 0,35 мм). Выбирайте мутанты, способные переносить 2 - дезоксиглюкозу (2DG) и не имеющие переносной активности глюкозы, зависящей от ПЭП, которые могут расти на питательных средах с глюкозой в качестве единственного источника углерода и энергии, что значительно снижает скорость приема сахара из - за использования системы приема, не связанной с ПТС, с низкой сродством (Ks = 11 мм). Растя в питательных средах с различным осмотическим давлением, дикие клетки потребляют меньше глюкозы и быстрее, чем растут. Когда клетки этих культур измеряются в стандартных условиях, они показывают аналогичную активность ПТС. Однако, когда клетки повторно суспендированы в буфере с различным осмотическим давлением, активность ПТС показывает корреляцию с осмотическим давлением. Этот ингибирующий эффект может объяснить снижение темпов поглощения и роста сахара, наблюдаемое в высокопроницаемых средах ферментации. Однако системы транзита глюкозы, не относящиеся к ПТС, не подвержены давлению проникновения питательной среды. Аналогичное подавление пропускной способности сахара наблюдалось в условиях промышленного производства при соответствующем увеличении давления инфильтрации питательной среды с накоплением глутамата. Это явление, таким образом, ограничивает процесс ферментации, поскольку снижение удельной скорости приводит к увеличению доли сахара, потребляемого для поддержания клеток, а также к снижению производительности продукта.

Ключевые слова: Перевозка глюкозы; Проницаемое давление; ферментация глутаминовой кислоты; Глутаминовая палочка;

Содержание исследования:

Влияние осмотического давления на жизнеспособность системы поглощения глюкозы PTS

Активность PTS в пределах осмотического давления 800 мOsmol / Kg остается постоянной, а затем линейно снижается по мере повышения осмотического давления. При осмотическом давлении 1900 мOsmol / Kg активность ПТС составляет всего 15% от максимальной.

Влияние осмотического давления на ферментацию глутаминовой кислоты

Накопление глутаминовой кислоты и вторичных метаболитов вызывает значительное увеличение осмотического давления в питательной среде, и для поддержания постоянного уровня pH добавление щелочи (в данном случае аммиака) еще больше усугубляет увеличение осмотического давления. Это явление наблюдалось у штамма 2262, чувствительного к температуре глутаминовой палочки, который способен достигать высокой концентрации продукта (глутамат > 85 г / л) и проникающего давления более 2000 мOsmol · kg - 1. Потребление сахара остается неизменным в течение первых нескольких часов, а затем постепенно

Постепенно снижается. Чтобы проверить, связано ли снижение активности с повышенным осмотическим давлением, вызванным аккумуляцией глутамина, вклад активности ПТС в общее потребление сахара был измерен в соответствии с тем, что было измерено в дикой бактерии Clostridium Pacifica ATCC17965, т.е. 4,5 mmol.g - 1,h - 1. В штаммах производства глутамина общий сахар потребляется быстрее, что указывает на более высокую активность инфильтрационных ферментов. Измеренные в ненасильственных условиях темпы поглощения глюкозы свидетельствуют о том что в глюкозу 2262 проникающие ферменты вносят до 25% общего потребления глюкозы. Измерение ингибирующего воздействия осмотического стресса на активность PTS в соответствии с методом экстракорпорального измерения системы транзита PTS, в условиях добавки глюкозы (вклад инфильтрационных ферментов незначителен) (с низким остаточным содержанием глюкозы, то есть менее 2g.l - 1), можно увидеть, что снижение потребления глюкозы очень близко к прогнозируемому снижению активности PTS (рисунок 3a). При использовании стратегии поддержания более высокой концентрации добавки глюкозы (50g.l - 1), улучшение потребления глюкозы может быть связано с высокой активностью инфильтрационных ферментов и высокой насыщенностью системы глюкозой, присутствующей в реакторе (рис. 3b), что приводит к высокому потреблению глюкозы в этой системе. Раннее появление, например молочной кислоты.

3 Влияние на производительность глутамата

Как только осмотическое давление в питательной среде увеличивается, одним из последствий снижения метаболической активности является значительное снижение производства глутамина в конце ферментации. Снижение потребления глюкозы может привести к снижению производства глутамата из - за увеличения доли глюкозы, преобразованной в CO2. Производство CO2 остается примерно постоянным на протяжении всего производственного периода, что указывает на постоянную потребность в биохимической энергии, получаемой из гликолитического метаболизма для поддержания клеток, пропорциональную биомассе в ферментере,

Поэтому снижение скорости потребления сахара требует увеличения доли используемого сахара. При расчете коэффициента удержания глюкозы / г / ч с использованием глутаминовой палочки 0,6 ммоль доля глюкозы, используемая для поддержания клеток, увеличилась с 15% от общего потребления сахара на начальной стадии производства глутамата до 40% при максимальном осмотическом давлении на поздней стадии ферментации (рис. 4). Снижение производства глутаминовой кислоты, наблюдаемое после ферментации, согласуется с изменениями в метаболическом потоке углерода, который поддерживает спрос. В зависимости от снижения метаболической потребности в кислороде во время ослабления метаболической активности, контроль концентрации остаточного сахара в зависимости от изменения кислорода может восстановить часть потери производительности.

4. Обсуждение

В этой статье показано, что ингибирование на более позднем этапе ферментации глутаминовой кислоты напрямую связано с контролируемым воздействием накопления продуктов и проникновения в окружающую среду на способность поглощать сахар. Это явление связано не с изменением уровня экспрессии генов, а с изменением биохимической активности транспортных систем в условиях осмотического давления. Кроме того, этот эффект обратим, потому что, как только инфильтрационное принуждение будет устранено, вымытые клетки все равно смогут восстановить свою способность транспортировать сахар. Аналогичным образом, при повторном подвешивании к высокопроницаемому буферу способность нормально растущих клеток переносить сахар также значительно снижается. С увеличением осмотического давления этот физиологический эффект может привести к снижению потребления сахара и замедлению метаболизма. Поскольку энергетические требования для поддержания биомассы остаются неизменными, и во многих случаях требуется дополнительная энергия для борьбы с таким давлением, это также приведет к снижению производительности продукта. Растущее потребление сахара будет использоваться для производства энергии и, следовательно, будет потеряно в виде углекислого газа за счет сокращения производства. Для ферментации глутаминовой кислоты урожайность и производительность значительно снижаются по мере увеличения осмотического давления питательной среды. Биохимический механизм, который вызывает снижение пропускной способности белка PTS, еще предстоит определить, но может быть связан со структурными изменениями в белковом / мембранном комплексе. Штамм, который производит глутаминовую кислоту более эффективно или быстрее, будет быстрее достигать порога проникновения, что приведет к ферментации в течение 24 часов без увеличения урожайности. Поэтому скрининг штаммов с высокой стойкостью к давлению полезен для ферментации, обеспечивая, что промышленные штаммы достаточно сильны, чтобы поддерживать высокую метаболическую активность при получении высоких продуктов. Другим способом преодоления этого ингибирования метаболизма является разработка системы ферментации, которая может интегрировать процесс извлечения вниз по течению, чтобы удалить продукты при накоплении ферментации.